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Alpha-突觸核蛋白操作指南(2)—細(xì)胞檢測(cè) (Cell Culture)

更新時(shí)間：2026-02-13   點(diǎn)擊次數(shù)：71次

細(xì)胞檢測(cè) (Cell Culture).png

以下步驟是使用1型和2型alpha突觸核蛋白前體纖維原(PFFs)處理神經(jīng)元，然后獲取ICC圖片的實(shí)驗(yàn)指南。1型alpha突觸核蛋白PFFs處理的原代大鼠海馬體神經(jīng)元顯示了路易體的內(nèi)含形成，而經(jīng)2型alpha突觸核蛋白處理的神經(jīng)元沒有路易體形成。

 

● 海馬體神經(jīng)元取自出生一天的Sprague Dawley大鼠幼鼠，然后接種在多聚-D-賴氨酸和層粘連蛋白包被的孔板上，每孔80,000個(gè)細(xì)胞。

● 前體纖維原在水浴超聲波儀中處理1小時(shí)，然后馬上進(jìn)行神經(jīng)元處理。

● 神經(jīng)元用4µg/mL 的前體纖維原處理。對(duì)照孔中只有轉(zhuǎn)移媒介不含alpha突觸核蛋白。

● 所有板孔7天后經(jīng)過一個(gè)50% 基液變化。

● 基液變化7天之后（離體處理14天后），所有板孔用4%甲醛固定20分鐘。

● 用過濾過的10mM PBS洗掉甲醛，洗三次(每次10分鐘)。

● 用1:1 PBS:LiCOR Odyssey Block (LiCOR, 927-40010)和30mL/mL的0.1% triton-X 100固定細(xì)胞30分鐘。

● 30分鐘之后, 用1:1 PBS:LiCOR Odyssey Block (含30mL/mL的 0.1% triton-X 100) 稀釋一抗，并加入到板孔中，4℃下過夜孵育。

● 第二天, 用過濾過的10mM PBS洗掉一抗溶液 ，洗三次(每次10分鐘)。

● 用1:1 PBS:LiCOR Odyssey Block (含30mL/mL的0.1% triton-X100) 稀釋二抗，然后加入到板孔里黑暗中孵育60分鐘。

● 60分鐘過后, 用過濾過的10mM PBS洗掉二抗溶液 ，洗三次 (每次10分鐘).

● 用落射熒光顯微鏡 (Olympus IX73, B&B顯微鏡) 20X目鏡觀察孔板拍照.

● 所有圖片都是在相同的比例和曝光時(shí)間下拍取的

 

一抗：抗-pSer129

復(fù)染色：Hoechst reagent

復(fù)染色稀釋度：1:3000

復(fù)染色孵育時(shí)間：1hr


 

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原代大鼠海馬體神經(jīng)元被1型突觸核蛋白前體原纖維(SPR-322)4µg/ml(D-F)處理后顯示路易體內(nèi)含物的形成，而當(dāng)被2型突觸核蛋白前體原纖維(SPR-317)4µg/ml(A-C)處理時(shí)沒有路易體內(nèi)含物形成. 

組織：原代海馬體神經(jīng)元. 

物種：斯普拉-道來氏大鼠. 

固定：由PFA制作的4% 甲醛.

一抗：小鼠抗pSer129抗體, 稀釋度 1:1000, 4°C下處理24小時(shí).

二抗：FITC羊抗小鼠(綠色) 稀釋度 1:700室溫下孵育1小時(shí).

復(fù)染色：Hoechst(藍(lán)色)細(xì)胞核染色, 1:4000室溫下孵育1小時(shí).

細(xì)胞定位：路易體內(nèi)含物.

放大倍數(shù)：20x.


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原代大鼠海馬體神經(jīng)元(DIV16)被1型小鼠α-突觸核蛋白前體原纖維(SPR-324)4µg/ml(D-F)處理后顯示路易體內(nèi)含物的形成以及細(xì)胞減少，而當(dāng)被對(duì)照突觸核蛋白前體原纖維(A-C)處理時(shí)沒有路易體內(nèi)含物形成及細(xì)胞減少. 

組織：原代海馬體神經(jīng)元. 

物種：斯普拉-道來氏大鼠. 固定：由PFA制作的3%甲醛固定20分鐘. 

阻斷：1:1 PBS:LiCOR Odyssey Block(LiCOR, 927-40010)以及30mL/mL, 0.1% triton-X 100 阻斷30分鐘. 

一抗：小鼠抗pSer129 抗體 (1:1000), 以及兔抗pSer129 (1:800), 4°C下處理24 小時(shí). 

二抗：ATTO 546 驢抗小鼠 (1:700)和ATTO 488驢抗兔 (1:700)室溫下孵育一小時(shí)(復(fù)合圖綠色). 

復(fù)染色：Hoechst (藍(lán)色) 細(xì)胞核染色, 1:3000 室溫下孵育1小時(shí). 

細(xì)胞定位：路易體內(nèi)含物. 放大倍數(shù): 20x.

 

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